GENTHERAPIE UND DAS IMMUNSYSTEM

Um sich vor Krankheitserregern (wie Bakterien, Viren, Parasiten und Pilzen) oder auch vor anderen Einflüssen oder Schadstoffen zu schützen, löst der menschliche Körper eine Immunreaktion als Antwort auf die Erreger aus, um diese zu bekämpfen.¹

Da für die Gentherapie Viren als Vektoren eingesetzt werden, stellen Immunreaktionen ein potenzielles Hindernis dar. 

Das Immunsystem kann sowohl die Kapsid-Komponenten (das Kapsid ist die Verpackung des viralen Genoms) als auch das Transgen (die funktionelle Kopie des krankheitsverursachenden Gens, das mit dem Gentherapievektor in den Körper gebracht wird) als "fremd" ansehen und somit eine Immunreaktion auslösen.^2-5

Daher können sowohl eine bereits bestehende Immunität gegen das Kapsid als auch eine Immunreaktion gegen das Transgen wichtige Faktoren für die Durchführbarkeit und den Erfolg einer Gentherapie darstellen.²
 

DAS ANGEBORENE UND DAS ERWORBENE IMMUNSYSTEM

Das angeborene Immunsystem^5-11
Das angeborene Immunsystem ist für die Erkennung und Bekämpfung von Infektionen in den ersten Stunden und Tagen nach der Exposition gegenüber einem neuen Krankheitserreger verantwortlich. Diese Reaktion ist nicht spezifisch für einen bestimmten Krankheitserreger, sondern für alle Krankheitserreger gleich und fungiert als erste Verteidigungsinstanz unseres Körpers. Aufgrund dieser nicht spezifischen Reaktion, wird das angeborene Immunsystem auch als "unspezifisches Immunsystem" bezeichnet.  

Im Zuge dieser Reaktion auf einen Krankheitserreger werden Substanzen freigesetzt, welche zu einer erhöhten Durchblutung führen und die Blutgefäße durchlässiger machen. Das erlaubt den Zellen des angeborenen Immunsystems, den sogenannten natürlichen Killerzellen und Fresszellen (Phagozyten), an den Infektionsort zu gelangen.  

Das angeborene Immunsystem verfügt, im Gegensatz zum erworbenen Immunsystem, über kein immunologisches Gedächtnis. Das bedeutet, dass das angeborene Immunsystem bei einer erneuten Infektion genauso wie beim ersten Mal reagiert, wohingegen das erworbene Immunsystem schneller und stärker auf eine neuerliche Infektion mit dem Krankheitserreger reagiert.   

Das erworbene (adaptive) Immunsystem¹
Das erworbene Immunsystem reagiert spezifisch auf einen Krankheitserreger und bietet einen langanhaltenden Schutz. Erworbene Immunantworten werden von Lymphozyten (B- und T- Zellen) ausgeführt. Hierbei gibt es zwei Arten von Immunantworten, die humorale und zelluläre (siehe Abb. 1). 

• Bei der zellulären Immunantwort werden T-Zellen (T-Helferzellen oder Zytotoxische T-Zellen) gebildet. Diese erfüllen verschiedene Aufgaben, wie das Erkennen und Zerstören von infizierten Zellen und das Aktivieren weiterer Immunzellen. 
   
• Bei der humoralen Immunantwort werden B-Zellen aktiviert. Diese können sich zu Plasma- oder Gedächtniszellen entwickeln. Die Plasmazellen setzen Antikörper frei, welche an das Antigen binden. Das Antigen kann zum Beispiel ein Bestandteil eines Krankheitserregers sein.  Die Gedächtniszellen sind das Gedächtnis der Immunabwehr und ermöglichen bei einer neuerlichen Infektion eine schnellere und stärkere Immunreaktion.  

Abb. 1: Die Stadien des adaptiven Immunsystems. Das Antigen auf Antigen-präsentierenden Zellen aktiviert B- und T-Lymphozyten, welche sich klonal vermehren und sich in Effektorzellen (Lymphozyten, die für die Zerstörung von Krankheitserregern sorgen) differenzieren. Bei der humoralen Immunantwort produzieren B-Lymphozyten Antigen-spezifische Antikörper, die das Antigen erkennen und eliminieren.^1,5 Die zelluläre Immunantwort sorgt mittels zytotoxischer T-Zellen (Tz), natürlicher Killerzellen (NK) und Makrophagen für die Zerstörung der infizierten Zellen. TH= T-Helferzellen
 

IMMUNANTWORT AUF GENTHERAPIEN

Rekombinante AAV (rAAV) Viren sind auf Grund ihres relativ milden pro-inflammatorischen Profils als Gentherapievektoren recht attraktiv. Trotzdem kann eine initiale angeborene Immunantwort gegenüber dem verwendeten rAAV stattfinden und auch eine bereits existierende Immunität gegenüber gewisse AAV Serotypen kann eine Rolle spielen.²

Angeborene Immunantwort
Interaktionen des zellulären Immunsystems mit den rekombinanten AAV Vektor Komponenten (Transgen oder Kapsid) können die Effizienz einer Gentherapie ebenfalls stark beeinflussen.² Nach der Aufnahme des viralen Vektors in die Zelle (via Endozytose), kann der rekombinante AAV Vektor in den Endosomen abgebaut werden.  Vektorkomponente und das Transgen werden durch sogenannten PRR‘s (englisch für ‚pattern recognition receptors‘) erkannt, die eine angeborene Immunantwort auslösen.¹⁵

Erworbene Immunantwort
Im Laufe unseres Lebens können wir auf natürliche Weise mit AAV (Adeno-Assoziierten Viren) in Kontakt kommen, wodurch eine Immunität aufgebaut wird (erworbenes Immunsystem).^2,16

Dieser Kontakt (Exposition) mit AAV führt zur Bildung von Gedächtniszellen (T und B Gedächtniszellen). Bei einem erneuten Kontakt mit den Viren wird das angeborene Immunsystem durch Antigen-präsentierende Zellen getriggert, was zur Ausschüttung von pro-inflammatorischen Zytokinen führt und die neutralisierende Antikörper Produktion sowie die Expansion eines Pools von bereits bestehenden CD8+ T-Gedächtniszellen startet.^2,13,16

Das Kapsid des für die Gentherapie veränderten Vektors ist dem natürlichen viralen Kapsid sehr ähnlich. Frühere Infektionen mit einem natürlich vorkommenden (Wildtyp) AAV können eine Immunreaktion gegen den Gentherapievektor auslösen. Diese bereits vorhandene Immunität kann die Virenübertragung in die Zielzellen hemmen, wodurch die Wirksamkeit der Gentherapie eingeschränkt wird.²

Abb. 2: Humorale Immunantwort. Durch eine vorangegangene AAV Infektion, können neutralisierende Antikörper (nAKs) gegen den bei der Gentherapie verwendeten AAV Vektor im Patienten vorliegen. Diese nAKs erkennen die Gentherapievektoren, markieren sie und verhindern so die Infektion der Zielzelle und die Übertragung des Transgens.^2,13,16

Abb. 3 :  Die zelluläre Immunantwort auf rekombinante AAV (rAAV) Vektoren. Durch die zelluläre Immunantwort wird eine zytotoxische T-Zellantwort ausgelöst, wodurch die infizierte Zelle attackiert und zerstört wird. Der rAAV Vektor wird nach Bindung an den Zielzellrezeptor über einen Prozess, der Endozytose genannt wird, in das Zytoplasma der Zelle aufgenommen, wo er im sog. Endosom weitertransportiert wird. Nach dem Freisetzen aus dem Endosom passiert der Vektor die Kernmembran und gibt das Transgen an den Zellkern ab. Der Vektor kann nach dem Auflösen des Endosoms und bevor er die Kernmembran erreicht auch von Proteasomen erkannt und abgebaut werden. Dadurch werden Antigenpeptide generiert, die danach an der Zelloberfläche von MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden. Diese Moleküle können spezifisch von zytotoxischen T-Zellen erkannt werden. Aktivierte T-Zellen attackieren oder zerstören die infizierte Zelle, was zum Verlust der Transgenexpression und somit auch des therapeutischen Effekts führt.^{5,15,16,18,19}  
Bild adaptiert von Vandamme C,et al 2017⁵, Baruteau J, et al. 2017¹⁶ und Collela P, et al 2018¹⁹
 

AUSWIRKUNGEN DER IMMUNANTWORT

Immunreaktionen gegen den verabreichten Vektor können die erwartete therapeutische Wirkung der Gentherapie in folgender Weise beeinflussen: 

• Verhinderung der initialen Transduktion - humorale Immunantwort
  Bereits vorhandene Antikörper gegen den in der Therapie verwendeten AAV Vektor sind das Resultat einer zurückliegenden Infektion mit einem AAV-Wildtypstamm. Diese neutralisierenden Antikörper erkennen die Gentherapievektoren, binden bzw. markieren das AAV-Capsid und verhindern so das Andocken an die Zielzellen und die Übertragung des Transgens.^5,13,16 Der Vektor kann somit neutralisiert bzw. eliminiert werden, bevor er die Zielzelle erreicht.^5,13
   
• Verlust des therapeutischen Gens - zelluläre Immunantwort
  T-Zellen können im Zuge der erworbenen Immunantwort aktiviert werden, was zu ihrer Expansion und der anschließenden Zerstörung der Vektoren führt.¹³ Dadurch kann die Übertragung des Transgens nicht ausreichend stattfinden, wodurch die Wirksamkeit der Gentherapie verloren geht.^4,5,18
   
• Erhöhte Leberenzymwerte 
  Bei einer Gentherapie, bei der die Leber das Zielorgan ist, müssen die Leberenzymwerte nach der Infusion regelmäßig kontrolliert werden.  Erhöhte Leberenzymwerte wurden vor dem oder zeitgleich mit einem Verlust des Transgens beobachtet.²¹
   
• Beschränkung auf einmalige Verabreichung  
  Gentherapien mit AAV-Vektoren sind derzeit auf eine einmalige Behandlung beschränkt, da nach der Behandlung neutralisierende Antikörper gegen den Vektor gebildet werden. Da nAK’s gegen mehrere Serotypen (Varianten des AAV Virus) vorliegen können, ist ein Switch zu einem anderen AAV Gentherapie Vektor eventuell nicht möglich.^{16,18,20,22,23}

ANSÄTZE ZUM MANAGEMENT DER IMMUNREAKTION 

Um die therapeutische Wirksamkeit der Gentherapie zu optimieren, müssen sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten berücksichtigt werden. Es werden derzeit viele Strategien diskutiert bzw. in klinischen Studien untersucht.  

Zu den aktuellen Überlegungen zum Management humoraler Immunantworten zählen unter anderem: 

• Rekrutierung von Patient*innen, die keine oder nur sehr wenige Antikörper gegen AVV bzw. dem bei der Gentherapie eingesetzten Vektor aufweisen.^2,19
   
• Verwendung hoher Vektordosen, damit die Neutralisierung der Vektorviren durch die Antikörper überwunden werden kann.^2,24
   
• Verwenden von leeren Kapsiden, um die zirkulierenden anti-AAV Antikörper abzufangen, um danach eine bessere Virenübertragung zu ermöglichen.^2,19
   
• Verabreichung von Immunsuppressiva, um die Immunantwort zu schwächen oder verhindern.^2,25
   
• Veränderung der AAV Vektoren, sodass sie weniger gut von Antikörpern, die gegen den Wildtyp AAV gerichtet sind, erkannt werden.^26-28
   
• Verwendung von Lipiden oder anderen zelleigenen Produkten, um die Vektoren zu maskieren, sodass sie den Antikörpern entgehen können.²⁵
   
• Wiederholter Plasmaaustausch vor einer Gentherapie, um anti-AAV Antikörper zu absorbieren.^19,25,30-32
   
• Unspezifisches Schneiden von zirkulierenden Antikörpern durch Enzyme (zB. Cystein Proteasen können eine nAB freie Periode ermöglichen, um den rAAV ungehindert in die Zellen zu bringen).
    
• Isolation und Transduktion der Zellen außerhalb des Körpers, welche anschließend zurück in den Körper überführt werden.^19,25,29

Folgende Maßnahmen werden derzeit ergriffen, um die zellulären Immunantworten zu managen: 

• Auswahl von Patient*innen, die keine vorherige Infektion mit AAV durchgemacht haben.²
   
• Verwendung von sogenannten hyperaktiven Vektorvarianten: Das Transgen wird dabei viel stärker abgelesen als gewöhnlich, was auch bei geringeren Vektordosen bessere Erfolge versprechen könnte.^2,33
   
• Verabreichung von Immunsuppressiva, um die T-Zellantwort zu blockieren.^{2,12,23,34,35}
   
• Verwendung von Proteasom-Inhibitoren oder Verwendung von mutierten Vektoren, die nicht effizient ubiquitiniert werden können: Fremde Proteine werden primär ubiquitiniert, bevor sie von Proteasomen erkannt und abgebaut werden. Die abgebauten Komponenten werden dann von MHC Klasse I Molekülen an der Zelloberfläche von infizierten Zellen präsentiert. Inhibiert man das Proteasom oder beeinflusst die Ubiquitinierung, so kann man die Präsentation von Vektorkomponenten an der Zelloberfläche reduzieren und so das Erkennen und die Zerstörung der Zelle durch zytotoxische T-Zellen verhindern.^2,19,34,36

Referenzen:
1. Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Chapter 24: The Adaptive Immune System.
2. Mingozzi F, et al. Blood 2013;122(1):23–36.
3. Stanford S, et al. Res Pract Thromb Haemost 2019;3(2):261–7.
4. Fitzpatrick Z, et al. Mol Ther Methods Clin Dev 2018;9:119–29.
5. Vandamme C, et al. Hum Gene Ther 2017;28(11):1061–74.
6. Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Chapter 25: Innate immunity.
7. Marshall JS, et al. Allergy Asthma Clin Immunol 2018;14:49.
8. Bessis N, et al. Gene Therapy 2004;11:S10–S17.
9. Kubelkova K, Macela A. Front Cell Infect Microbiol 2019;9:241.
10. Lai C-Y, et al. Front Immunol 2019;10:179.
11. Dunkelberger JR, Song WC. Cell Research 2010;20:34–50.
12. Nathwani AC, et al. Hematol Oncol Clin N Am 2017;31:853–68.
13. Naso MF, et al. BioDrugs 2017;31(4):317–34.
14. Konkle BA, et al. Blood 2020. doi: 10.1182/blood.2019004625. Online ahead of print.
15. Li C, Samulski RJ, et al. Nat Rev Genet 2020;21:255–72.
16. Baruteau J, et al. J Inherit Metab Dis 2017;40(4):497–517.
17. Liu Q, et al. Nature Gene Ther 2014;21:732.
18. Kattenhorn LM, et al. Hum Gene Ther 2016:27;947–61.
19. Collela P, et al. Mol Ther Methods Clin Dev 2018;8:87–104.
20. Kruzik A, et al. Mol Ther Methods Clin Dev 2019;14:126–33.
21. Sidonio RF, et al. Blood Rev 2020;9;100759.
22. Ohmori T. Int J Hematol. 2020;111(1):31–41.
23. George LA. Blood Adv  2017;1(26):2591–9.
24. Mingozzi F, et al. Sci Transl Med 2013;5:194ra92.
25. Muhuri M, et al. J Clin Invest 2021;131:e143780.
26. Barnes C, et al. Curr Opin Biotechnol 2019;60:99–103.
27. Asokan A, et al. Nat Biotechnol 2010;28:79–82.
28. Mingozzi F, et al. Nat Med 2007;13:419–22.
29. Mimuro J, et al. Mol Ther 2013;21:318–23.
30. Monteilhet V, et al. Mol Ther 2011;19:2084–91.
31. Chicoine LG, et al. Mol Ther 2014;22:338–47.
32. Bertin B, et al. Sci Rep 2020;10:864.
33. Finn JD, et al. Blood 2012;120(23):4521–3.
34. Finn JD, et al. Mol Ther 2010;18:135–42.
35. Furukawa A, et al. Transplantation 2016;100(11): 2288–300.
36. Tanaka J. Proc Jpn Aca 2009;85:12–36.